مروری بر روشهای استخراج کراتین از الیاف و کاربردهای آن در منسوجات پزشکی

• مقدمه:

   پروتئین، فراوان­ترین مولکول­های آلی موجود در سلول­های زنده و متشکل از یک یا چند زنجیر پلی­پپتید است که هر زنجیر نیز از اتصال آمینواسیدها به یکدیگر از طریق پیوندهای پلی­پپتیدی تشکیل شده است. این زنجیرهای پلی­پپتیدی که به منظور تشکیل یک ساختار سه بعدی منحصر به فرد حین سنتز تا می‌خورد، به وسیله ترتیب آمینواسیدهای موجود در آن شناسایی می‌شود. شکل 1 ساختار کلی پروتئین­ها را که در چهار سطح بررسی می‌شود نشان می‌دهد. هر ساختار مبنای تشکیل ساختار بالاتر است. ]1[

   کراتین یکی از خانواده پروتئین‌های لیفی موجود در طبیعت است که در پستانداران، خزندگان، پرندگان و ماهی‌ها و در تمامی قسمت‌های بدن از جمله شاخ، خز، پشم، پوست، پر و ... یافت می­شود. به طور کلی «کراتین» اشاره به پروتئین­های نامحلولی دارد که در فیلامنت­های واسطه[1] یافت می­شود و به بخش عمده‌ای از اپیتلیای سیتوپلاسمی و ساختارهای فرعی اپیدرمال مانند مو، پشم، شاخ و ناخن تبدیل می­شود. عملکرد اولیه کراتین‌ها، محافظت از سلول‌های اپیتلیال در برابر تنش­های مکانیکی و غیر مکانیکی است که می‌تواند به مرگ سلول منجر گردد. کارکردهای دیگر کراتین‌ها شامل نشانه­گذاری یاخته[2]، پاسخ به استرس­ها و آپوپتوز (خزان یاخته‌ای یا مرگ برنامه‌ریزی شده سلول) است. کراتین به طور کلی یک ماده تنها در نظر گرفته می­شود در حالی که ترکیبی از پروتئین­ها و آنزیم­هاست. شکل2 نمای کلی از آمینواسیدها، کراتین و فیلامنت های واسطه را نشان می‌دهد.

شکل 2: آمینو اسیدها، کراتین و فیلامنت های واسطه]2[

   به طور کلی به جز پشم و مو، استفاده از کراتین در شکل طبیعی آن دشوار است و بنابراین، برای کاربردهای گوناگون استخراج می­شود. علاوه بر این، پپتیدهای تشکیل دهنده پروتئین وقتی درون توالی پروتئین قرار دارد، فعال نبوده اما زمانی که آن را بتوان از توالی پروتئین خارج کرد به عنوان یک ماده زیست فعال می­توان کاربردهای مختلفی برای آن تعریف کرد.

• تقسیم بندی کراتین:

   براساس ساختار و خواص متمایزی که کراتین­ها دارند به دو دسته «نرم» و «سخت» تقسیم می‌شوند. کراتین‌های نرم آن‌هایی هستند که به‌عنوان فیلامنت‌های واسطه در اپی تلیال یافت می‌شوند. این دسته از کراتین‌ها به طور عموم، در بسته‌های چیده شده‌ای قرار دارند و مسئول انعطاف پذیری مکانیکی سلول‌های اپی تلیال هستند.

   کراتین‌های سخت آن‌هایی هستند که در آرایه‌های منظمی در ماتریس پروتئین‌های غنی از سیستئین در مو، ناخن، سم، منقار، پنجه و ... یافت می‌شود و به ساختار سخت اپیدرمال کمک می‌کند.

   همچنین کراتین را براساس ساختار آن می‌توان به دو دسته α-کراتین و β-کراتین تقسیم کرد. α-کراتین به صورت لیفی و ریشه‌ای است و شامل یک ساختار مارپیچ همراه با میکروفیبریل‌هایی است که در ماتریس آمورف کراتین جاسازی شده و در امتداد محور لیف قرار گرفته ‌است. این مناطق آمورف حاوی مقادیر گوگرد بالایی با پیوندهای دی‌سولفیدی گوناگونی از باقیمانده‌های سیستئینی است.

    β-کراتین‌ها در ساختار سخت ایجاد می‌شوند و حلالیت کم دارد و عمدتا چون این نوع کراتین، لایه‌های بیرونی را تشکیل می‌دهد دارای مقاومت شیمیایی و مکانیکی بسیار زیادی است. شکل 3 ساختار سه بعدی پروتئین کراتین αو β را نشان می­دهد. همچنین در جدول 1 نمونه هایی از مواد بر پایه کراتین های گوناگون αو β و همین طور ترکیب آن ها مشاهده می­شود.

شکل 3: شماتیکی از ساختار سه بعدی پروتئین کراتین(الف)، مارپیچ α با تاب خوردن زنجیرهای پلی پیتیدی به شکل پیچ به وجود می آیند (ب)، ساختار صفحه ای β  نتیجه پهن شدگی و کشیده شدن بیشینه زنجیرهای پلی پپتیدی است(ج).

جدول 1: نمونه هایی از منابع کراتین دار موجود در طبیعت

   بسته به نقطه ایزوالکتریک، کراتین‌ها را می‌توان به دو دسته اسیدی (نوع Ⅰ) و بازی (نوع Ⅱ) نیز تقسیم کرد. در جدول 2، مشخصات دو نوع کراتین بر اساس اندازه و نقطه ایزوالکتریک آمده است.  اگر چه کراتین‌ها نقطه ایزوالکتریک متفاوتی دارند اما نوع و ترتیب آمینواسیدها در کراتین‌های اسیدی و بازی مشابه به نظر می‌رسد. به عنوان مثال، کراتین پوست انسان و پوست حیوانات مختلف ترکیب مشابهی از آمینو اسیدها را نشان می‌دهد.

جدول 2: تقسیم بندی کراتین بر اساس اندازه و نقطه ایزوالکتریک

در این مقاله ما به بررسی الیاف پروتئینی به عنوان منابع کراتینی می‌پردازیم.

• الیاف پروتئینی:

3-1) پشم:

   پشم به‌عنوان یکی از قدیمی‌ترین الیاف شناخته شده است که در دسته الیاف طبیعی پروتئینی قرار گرفته و به دلیل خواص منحصر به فردش از اهمیت فراوانی در صنایع نساجی برخوردار است. سالانه بیش از 5/2 میلیون تن پشم در سراسر جهان تولید می‌شود. ایران در سال‌های اخیر، همواره جزء ده کشور برتر دنیا در تولید این الیاف ارزشمند بوده است. ]3-4[. 

   بر اساس تخمین‌های صورت گرفته، پشم بیش از 170 نوع پروتئین گوناگون به صورت غیر یکنواخت دارد که در آن توزیع شده است. این ترکیب پیچیده و غیر همگن سبب ایجاد خواص فیزیکی و شیمیایی متفاوت در قسمت‌های گوناگون لیف گردیده است. زنجیرهای پلی پپتیدی به وسیله برهم‌کنش‌های کووالانسی و غیرکووالانسی به یکدیگر اتصال یافته و پروتئین‌های مختلف در پشم را به ‌وجود می‌آورد.  مهم‌ترین پیوند در پشم، پیوند دی‌سولفیدی محتوی گوگرد است که در حین رشد لیف طی فرآیندی به نام کراتینه شدن تشکیل می‌گردد. این پیوند سبب نامحلول شدن الیاف کراتینی در آب و پایداری آن در برابر حملات شیمیایی و فیزیکی می‌گردد. پیوند حائز اهمیت دیگر، پیوند ایزوپپتید بین آمینواسیدهای بازی یا اسیدی است. علاوه بر این پیوندهای شیمیایی، بر هم کنش های دیگری بین گروه های جانبی آمینو اسیدها نیز وجود دارد که به پایداری لیف در شرایط تر و خشک کمک می‌کند.

   پروتئین پشم (کراتین) از آمینواسیدهای مختلف با عوامل متفاوت تشکیل شده که به وسیله عملیات آبکافت، جداسازی و شناسایی می‌شود. آمینواسیدهای اسیدی شامل اسپارتیک اسید، گلوتامیک اسید، اسپارجین و گلوتامین و آمینو اسیدهای بازی شامل ارجینین، لایسین، هیستیدین و تریپتوفان می‌باشد. بنابراین لیف پشمی آمفوتر بوده و می‌تواند پیوندهای داخلی نمکی برقرار نماید. در نقطه ایزوالکتریک (pH=4.8-4.9) تعداد گروه‌های کاتیونیک و آنیونیک برابر شده و لیف در پایدارترین شرایط خود قرار دارد]3[. رابطه 1، وضعیت پروتئین پشم را در شرایط اسیدی، بازی و خنثی نشان می­دهد.

رابطه 1

   علاوه بر اتصالات یونی، آمینواسیدهای محتوی گروه‌های هیدروکسیل (مانند سرین، تایروسین و ترونین) قادر به برقراری پیوندهای هیدروژنی بین مولکولی بوده و لذا به پایداری لیف کمک می‌کند. بر خلاف سایر پروتئین‌ها، تعدادی از این آمینواسیدها دارای زنجیرهای جانبی محتوی گوگرد است که می‌توان به سیستین، سیستیک اسید، متیونین، تیوسیستین و لنتیونین اشاره کرد.    از میان این آمینواسیدها، سیستین محتوی بیش ترین مقدار گوگرد به شکل پیوندهای دی سولفیدی است. با وجود این که پیوندها در لیف خشک پایدار است، آرایش لیف تحت تنش در حضور حرارت و آب به آسانی تغییر می‌کند. این پدیده سبب سهولت در تغییر آرایش ساختاری پروتئین پشم شده و در نتیجه به آزاد شدن تنش های مولکولی در لیف منجر می‌گردد.

   در مجموع نه‌تنها پیوندهای نمکی (ناشی از بر هم کنش الکترواستاتیک بین گروه‌های آنیونی و کاتیونی زنجیر جانبی) و هیدروژنی (بین گروه‌های دهنده الکترون مانند هیدروکسیل و آمین و گروه‌های پذیرنده الکترون مانند کربوکسیل) به پایداری لیف پشمی کمک می‌کند؛ بلکه پیوندهای دی‌سولفیدی بین باقی مانده‌های سیستینی، پیوندهای کووالانسی ایزوپپتیدی بین باقی‌مانده‌های گلوتامیک اسید و لایسین و نیروهای آب گریز بین زنجیرهای جانبی غیرقطبی آمینواسیدها نیز در این امر دخالت موثری دارد]5و6[.

3-2) الیاف پر:

   الیاف پر نیز به عنوان یک لیف پروتئینی دیگر، حدود 5 تا 7 درصد وزن ماکیان را تشکیل می‌دهد و دارای خصوصیات منحصر به فردی چون انعطاف پذیری، سختی سطح، نسبت بالای طول به قطر، آب گریزی، ساختار پیچیده و پایدار، دانسیته و هزینه کم، دوستدار محیط زیست و عایق صورتی و حرارتی می‌باشد. پر ماکیان به علت داشتن پروتئین بالا، به عنوان منبع تغذیه حیوانات و کود استفاده می‌شود که فرآیند این فرآوری پر هزینه است. همچنین با توجه به مقادیر قابل توجه چربی موجود در پر، می‌توان از آن برای تولید سوخت زیستی استفاده کرد. همچنین به علت دانسیته پایین پر، جایگزین مناسبی به عنوان تقویت‌کننده کامپوزیت‌ها به جای الیاف مصنوعی به نظر می‌رسد. نمودار 1، نشان می دهد که پر مرغ به عنوان یک منبع حائز اهمیت کراتین مطرح است و همین طور روند افزایش تولید و مصرف گوشت مرغ، این منبع را حائز اهمیت­تر می­سازد.

نمودار 1: موجودی جهانی منابع کراتین بر اساس منبع آن (الف)

تولید جهانی گوشت به تفکیک نوع آن طی سال های 2013-1999 (ب)

   اغلب، پر پرندگان به عنوان محصول ضایعاتی تلقی شده و هر ساله میلیون‌ها تن در سراسر جهان تولید می‌گردد. در اغلب موارد این پرها به وسیله سوزاندن و یا دفن کردن از بین می‌روند؛ در حالی که چنان که اشاره شد می‌توان از آن به عنوان یک منبع پر بازده و کارآمد در مصارف متعدد استفاده نمود. همچنین از پر به منظور تولید منسوجات بی بافت و پلاستیک‌های زیست تخریب پذیر هم می‌توان استفاده کرد. الیاف پر که از پروتئین آب گریز کراتین با استحکام بالا تشکیل شده، دارای ساختار نیمه بلوری و پیوندهای عرضی است.  پر متشکل از 91 درصد پروتئین (کراتین)، 1 درصد لیپید و 8 درصد آب است. الیاف بلند و انعطاف پذیر پر از کراتین دارای ساختار مارپیچی α تشکیل شده، به نحوی که کراتین‌های صفحه ای β فضای بین مارپیچ های α را پر می‌کند. پیوندهای هیدروژنی بین زنجیرهای گوناگون آمینواسید سبب استحکام بالای آن می‌گردد. تشکیل سلول های α-کراتین در غلاف و تبدیل آن به β-کراتین در بدنه و همچنین افزایش پیوندهای عرضی دی‌سولفیدی در حین کراتینه شدن به وقوع می‌پیوند. کراتین های β ماکیان، یک خانواده چند ژنی از حدود 20 پروتئین را تشکیل داده که در حین رشد و تقسیم سلولی سنتز می‌گردد. کراتین پر نیز مانند پشم دارای تعداد زیادی پیوندهای عرضی است. با این وجود کراتین پشم به لحاظ مورفولوژیکی ساختار پیچیده تری نسبت به کراتین پر دارد. پروتئین پشم، ناهمگن و دارای ساختار مارپیچی و وزن مولکولی بالاتر است. (kDa 55-10)  این در حالی است که کراتین پر با وزن مولکولی تقریبا kDa 10 به صورت مولکول پروتئینی کوچک و یکنواخت در ابعاد است. نمودار ، توزیع آمینو اسید های کراتین استخراج شده از پر مرغ و پشم را به یکی از روش های مرسوم استخراج مقایسه نموده است.

نمودار 2: مقایسه توزیع آمینو اسید های کراتین استخراج شده از پر مرغ و پشم به روش هیدرولیز قلیایی ]7-8[

   تفاوت اصلی دو نوع α-کراتین و β-کراتین در فیلامنت‌های واسطه می‌باشد. این فیلامنت‌ها در ساختار α-کراتین به شکل مارپیچ‌های تا خورده α بوده که از ترکیب این مارپیچ‌ها، میکروفیبریل‌ها تشکیل می‌گردد. در حالی که ساختار β-کراتین به شکل صفحه‌ای بوده و قطر فیلامنت‌های واسطه در آن کمتر است. سختی ساختار صفحه ای β بیش تر از مارپیچ α بوده و رفتار مکانیکی هر دو نوع کراتین به رطوبت محتوی بستگی دارد؛ به نحوی که افزایش رطوبت محتوی به دلیل جذب رطوبت توسط ماتریس کراتین سبب کاهش سختی و مدول می‌گردد. ]9[

   α-کراتین غنی از باقی‌مانده‌های سیستئینی است که با پیوندهای دی سولفیدی، زنجیرهای پلی پپتیدی مجاور را به هم متصل می‌کند. اگر مقدار گوگرد در این ساختار کم باشد، آن گاه α-کراتین، نرم (در پوست) و در غیر این صورت سخت (در پر، مو و ناخن) نامیده می‌شود. خاصیت ارتجاعی مو و لیف پشمی در نتیجه تمایل ساختار حلقوی پیچشی آن به بازگشت به حالت اولیه بعد از کشیده شدن است. اگر تعدادی از پیوندهای دی سولفیدی شکسته شود، آن گاه لیف α-کراتین توانایی کشیده شدن تا دو برابر طول اصلی را خواهد داشت. در این صورت زنجیر پلی‌پپتید به شکل صفحه‌ای β در می‌آید. این تغییر ساختار از شکل α به β در مقادیر کشش کم رخ می‌دهد. حلقه‌های مارپیچی پشم تحت تنش در آب به شکل زنجیر صاف در می‌آید. اگر زنجیرها در این شکل کشیده شده با برقراری پیوندهای جدید تثبیت نگردد، با حذف نیروی تنشی قادر به بازگشت به شکل مارپیچی خواهد بود و در حقیقت این تغییر ساختار برگشت‌پذیر سبب ایجاد خاصیت ارتجاع پذیری در پشم شده است]10[.

• استخراج کراتین:

   برای استخراج ابتدا کراتین را از کورتکس جدا می‌کنیم، این کار با استفاده از مواد شیمیایی  برای شکستن پیوندهای دی سولفیدی موجود در بافت‌های کراتینه انجام می‌شود. کراتین‌های آلفا و بتا از طریق اکسایش یا کاهش به ساختار بدون پیوندهای عرضی خود باز می‌گردند که طی آن سیستین به ترتیب به اسید سیستیک و سیستئین تبدیل می‌شود. پروتئین‌های آزاد استخراج شده از طریق محلول‌های دناتورکننده، محلولی ایجاد می‌کنند که می‌تواند از طریق فیلتراسیون و دیالیز خالص‌سازی شود. روش‌های مهم به‌ کار گرفته شده برای حل کردن و جداسازی کراتین از منابع کراتین دار شامل این موارد است: روش احیا، اکسیداسیون، استخراج قلیایی، انفجار بخار، تجزیه از طریق یون سولفیت (سولفیتولیز) و مایعات یونی.

   روش استخراج قلیایی به مقادیر قابل توجهی مواد شیمیایی قلیایی برای هیدرولیز و خنثی سازی اسیدها نیاز دارد. زنجیر اولیه کراتین و ساختار آن در روش هیدرولیز تخریب می‌شود. در روش احیا از مواد کاهنده مانند تیول‌ها (مثلا مرکاپتواتانول) که در بیش‌تر گزارش‌ها برای شکستن پیوند دی‌سولفیدی سیستین (S-S) و تشکیل سیستئین (S-H) آمده است، استفاده می‌شود. علی‌رغم این واقعیت که ساختار زنجیری کراتین در این روش حفظ شده است اما استفاده از موادی مثل مرکاپتواتانول معایبی هم چون گران بودن، سمی بودن و مضر بودن را به همراه دارد. سولفید سدیم به عنوان یک جایگزین شیمیایی ارزان‌تر از آن معرفی شده و به طور گسترده‌ای در استخراج کراتین از پشم تا مرحله تشکیل سیستئین و سولفونات سیستئین (R-S-S-O3H) به عنوان جایگاه‌های پایدار برای کراتین حل شدنی به کار می‌رود]11[. هر دو روش مقادیر زیادی اوره برای دناتوره کردن پروتئین نیاز دارد که می‌تواند خواص فیزیکی و شیمیایی کراتین نهایی را تغییر دهد.

   مایعات یونی به طور نسبی حلال‌های سبز جدیدتری است که توجه زیادی را به خود جلب نموده است و برای بازیافت کراتین از پشم به کار می‌رود. با این حال، این فرآیند باید تحت جریان گاز نیتروژن انجام شود و نیاز به کنترل دقیق دما دارد. مواد اولیه باید در مقادیر کم و به مایع داغ اضافه شود و کراتین به دست آمده در آب نامحلول است]12[ .

   در روش اکسیداسیون برای دهه‌ها از مواد اکسیدکننده مانند اسیدفرمیک یا پراستیک اسید استفاده شده‌ است تا یک اسیدسولفونیک (RSO3H) به‌دست آید. فرآیند معمولا فرآیندی زمان‌بر است و بیش از 24 ساعت برای زمان واکنش مورد نیاز است تا بازدهی مناسب به‌دست آید]13[. بسته به وجود یا عدم پیوندهای دی‌سولفیدی در ساختار کراتین، زیر بخش‌های گوناگونی می‌تواند حاصل شود که خواص فیزیکی متفاوتی خواهد داشت.

   ساختار پایدار کراتین با پیوندهای دی‌سولفیدی در زنجیر پلی پپتیدی همراه است. این پیوند را می‌توان با استفاده از مواد شیمیایی حاوی تیول کاهش داد. مواد کاهنده گوناگونی تحت تاثیر شرایط مختلف در حضور عوامل دناتوره‌کننده پروتئین و ‌pHهای گوناگون گزارش شده است. به عبارتی دیگر، کاهش پیوندهای سیستئینی توسط گروه‌های تیول مانند مرکاپتواتانول و یا تیوگلیکولیک اسید که می‌تواند کراتین محلول را از طریق یک واکنش جابه‌جایی نوکلئوفیلیک برگشت پذیر تولید نماید]16 -14[. اوره به‌عنوان یک دناتوره‌کننده پروتئین، به‌ طور عمومی برای افزایش حلالیت پذیری کراتین در آب به کار می‌رود. اوره در غلظت بالا (m8) باعث تورم ساختار کراتین از طریق تضعیف برهم‌کنش‌های هیدروفوبیک در زنجیر پلی پپتیدی و تسهیل اثر کاهنده بر زنجیر مذکور می‌گردد. در اکثر مطالعات، تیول قلیایی مورد استفاده قرار گرفته است و پژوهش گران تلاش کرده‌اند تا با استفاده از گاز بی اثر و حذف هوای فضای پیرامون تیول، اکسیداسیون خود به خودی تیول را کاهش دهند. ورود نیتروژن در فرآیند باعث پیچیده‌تر شدن کار گشته و گاهی ممکن است به علت اکسیداسیون خودکار صورت گرفته ترکیباتی با برخی از ناخالصی‌های نمونه‌ها در حمام‌های گوناگون ایجاد سازد.

   در بسیاری از مطالعات، استخراج کراتین از پشم با هدف دست‌یابی به پروتئین تخریب شده با بازدهی بالا بررسی شده است. با این حال، در بسیاری از این مطالعات، فرآیند در دمای بالا یا pH بالا انجام شده که منجر به تخریب پروتئین و تشکیل لانتیونین در طول فرآیند گردیده است]17[. 

   اغلب مطالعات صورت گرفته فاقد اطلاعاتی در مورد خواص فیزیکی و شیمیایی کراتین به دست آمده است. شاید به دلیل روش‌های آماده سازی دشوار و بی ثباتی کراتین کاهش یافته، خواص کراتین استخراج یافته کاهش یافته مورد ارزیابی قرار نگرفته است.

   یامائوچی و همکاران با استفاده از اوره، 2-مرکاپتواتانول و سدیم دودسیل سولفات (SDS) توانستند یک محلول کراتین کاهش یافته ثابت و پایدار با بازدهی استخراج 50 – 45 درصد تهیه نمایند. دودسیل سولفات سدیم نرخ استخراج و پایداری کراتین بازیافتی در محلول آبی را افزایش می‌دهد. با حذف 2-مرکاپتواتانول و اوره در طی آنالیز، پلی پپتیدهای کراتین می تواند تجمع یافته و سیستین می‌تواند اکسیده شود. با استفاده از سطح فعال می‌توان از تجمع زنجیر پلی پپتیدی جلوگیری کرد]18[.

   هنگامی که در فرآیند استخراج کراتین از مقدار زیادی SDS استفاده می‌شود، اکسیداسیون کراتین به آهستگی صورت می‌گیرد. البته گروه دیگری از پژوهش‌گران، هیچ رابطه مثبتی بین بازدهی استخراج کراتین و مقدار دودسیل سولفات سدیم پیدا نکردند. به دلیل تشکیل یک کمپلکس بین سطح فعال و کراتین، مقدار کمی دودسیل سولفات سدیم می‌تواند در روش تولید فیلم یامائوچی باقی بماند.

   برای تایید این یافته ها، شرویین[3] و همکاران مشاهده کردند که تنها 67%  SDS افزوده شده پس از 24 ساعت دیالیز و 80% آن پس از 65 ساعت حذف شده است و 20% آن در کراتین استخراج شده نهایی باقی مانده است]19[. شایان ذکر است وجود این باقی مانده سطح فعال باعث نمی‌شود که هیچ اثری بر ایمنی کراتین استخراج شده بگذارد؛ چرا که محققان هیچ سمیت سلولی فیبروبلاستی یا اثر منفی بر هضم کراتین توسط تریسین مشاهده نکردند. با این حال باقی مانده SDS بایستی در مصارف غذایی و دارویی در نظر گرفته شود.

   در مطالعه ای که توسط گوپتا[4] و همکاران در سال 2012 در خصوص استخراج پروتئین کراتین طبیعی از پر مرغ انجام شده است، از احیاکننده‌های مختلف استفاده شده است. نقش عوامل احیاکننده کاهش ثبات الیاف کراتینی موجود در پرها می‌باشد. این واکنش‌گرها، پیوند دی‌سولفیدی، هیدروژنی و اتصالات نمکی الیاف کراتینی را به منظور حل کردن آن‌ها و تبدیل به محلول پروتئینی می شکند]20[.

   اطلاعات در مورد رفتار اتصال سطح فعال به کراتین برای کاربرد بالقوه کراتین حائز اهمیت است. اگر چه این اثر متقابل بسته به نوع منبع کراتین (مو، پشم، ناخن و ...)  به علت ساختارهای ثانویه و سوم و اختلاف درجه اتصال عرضی پیوندهای دی‌سولفیدی می تواند بسیار پیچیده باشد.

   سطح فعال‌های کاتیونیک و خنثی به اندازه سطح فعال‌های آنیونیک مانند SDS موثر نیست. برخی مطالعات اولیه نشان داد که افزایش غلظت تیول به بالای m 5/0 تاثیر کمی بر استخراج کراتین دارد. با این حال کیاهارا[5] و همکاران نشان دادند که m5/0  2-مرکاپتواتانول به‌کار می‌رود صرفا نوع اپیدرمال کراتین‌ها مثل کراتین متمایزکننده پوست می‌تواند استخراج گردد؛ در حالی که انواع کراتین مو می‌تواند با افزایش غلظت تیول به m 2 استخراج گردد]21[.

   ناکامورا[6] و همکاران یک روش اصلاح شده از روش یامائوچی با ترکیب تیواوره و اوره همراه با MEC به عنوان ماده کاهنده پیشنهاد دادند. این روش که به روش شیندای شناخته شده است و در دانشگاه شینشو[7] توسعه یافته بر این اساس است که ترکیب تیو اوره و اوره همراه با MEC می تواند پروتئین را از قشر کورتکس به طور موثرتری در مقایسه با روش‌های معمولی حذف کند. پژوهشگرانی که روش شیندایی[8] را با روش یامائوچی[9] مقایسه کردند گزارش داده‌اند که راندمان روش مذکور 65% بود که نسبت به راندمان روش یامائوچی که 50-45% است به طور معناداری بیش‌تر است. همچنین پروتئین استخراج شده با روش شیندایی شامل کراتین با وزن مولکولی بالا (kDa135-110)، متوسط (kDa60-40) و پایین (kDa20-10) است؛ در حالی که در روش یامائوچی صرفا پروتئین با وزن مولکولی 40 تا 60 کیلو دالتون حاصل می‌شود]22[.

   به همین علت ناکامورا و همکاران، افزودن تیواوره را پیشنهاد کردند تا جداسازی پروتئین‌های کراتین بهبود یابد. محققان همچنین روش شیندایی را بر روی منابع گوناگون (پر مرغ، پشم و ...) آزمودند و راندمان بالای 75% گزارش شد که در مقایسه با راندمان 12- 5% به دست آمده در روش شیندایی در تمامی نمونه‌های کراتین آزموده شده موثرتر بود و بنابراین، این روش را می‌توان در همه انواع منابع کراتین دار به کار برد. علی‌رغم راندمان بالا و توانایی استخراج کراتین از مواد کراتینه گوناگون با این روش، پروتئین حاصل شده فقط می‌تواند در شکل کاهش یافته در محلول نگهداری شود و نیاز به مواد احیاکننده برای باقی ماندن در محلول لازم است]22[.

   کراتین حاصله پس از برداشت از MEC رسوب می‌کند و بنابراین استفاده از دیالیز برای حذف اوره، تیواوره و MEC می‌تواند روی حلالیت کراتین اثر بگذارد. به علاوه، پایداری محلول به مقدار زیادی بستگی به نسبت غلظت MEC  به اوره دارد و تغییرات کوچک در این نسبت می‌تواند باعث ته‌نشینی و رسوب پروتئین گردد.

   محصولاتی که توسط پروتئین استخراج شده به روش شیندایی می‌توان تهیه کرد بسیار محدود بوده و تولید موادی مثل هیدروژل کراتین بسیار دردسر ساز است. باروس با ثبت پتنت، توانست بر بی‌ثباتی پروتئین در روش شیندایی غلبه کند. در این روش، محلول پروتئین تغلیظ شده تا جایی که اوره شروع به بلورینه شدن می‌کند. سپس محلول در معرض هوا یا اکسیده شدن قرار می‌گیرد که منجر به تشکیل هیدروژل الاستیک و انعطاف‌پذیر با خواص خوبی برای شکل دادن، پردازش و بررسی و کنترل می‌گردد. این هیدروژل هم چنین به منظور حذف تمامی عوامل شیمیایی اضافه شسته ‌شود.

   اخیرا ژو[10] و همکاران، MEC را با سیستئین که یک ماده کاهنده دوستدار محیط زیست است جایگزین کرده‌اند. این محققان پیشنهاد کرده‌اند که یک شکست کنترل شده پیوند دی سولفیدی با استفاده از سیستئین به دست آید. این محققان گزارش نموده‌اند که محصول نهایی، خواص مکانیکی خوبی دارد و آن را می‌توان برای تهیه الیاف ریسید. بنابراین، روش مورد اشاره برای توسعه موفقیت آمیز فیلم‌ها، اسفنج‌ها و دیگر شکل‌های مکانیکی پایدار مناسب می‌سازد]23[.

   کاهش پیوندهای دی‌سولفیدی با استفاده از MEC یک روش استخراج کراتین با راندمان خوب است که دارای ساختار پایدار هم می‌باشد. با این حال، MEC یک ماده شیمیایی سمی است و به علت هزینه‌های بالای تجاری و زیست‌ محیطی‌ای که دارد نامطلوب است و بوی نامطبوعی هم دارد. سولفیت سدیم می‌تواند جایگزین خوبی برای شکستن پیوندهای سولفیدی در استخراج کراتین باشد. این روش، اثرات صنعتی و تحلیلی بر فرآیند پردازش پشم دارد.

     یون سولفیت پیوندهای دی‌سولفیدی را شکسته و آنیون‌های S-سولفونات طی یک واکنش برگشت‌پذیر تولید می‌شود. همچنین می‌توان، دی سولفید را به دو آنیون S-سولفونات طی یک واکنش برگشت‌ناپذیر تبدیل کرد]24[.

   مایعات یونی(IL)، نمک هایی را می‌گویند که از ترکیب کاتیون‌های آلی و تعدادی از آنیون‌های غیرآلی که در دمای زیر  100 ذوب می‌شوند تشکیل می‌شود]25و26[. این مایعات، برخی خواص فیزیکی و شیمیایی منحصر به فرد از جمله فشار بخار کم، هدایت یونی بالا، غیرقابل اشتعال بودن، پایداری حرارتی بالا، حلالیت بالا در حلال‌های خاص و غیر فرار بودن را دارد. با توجه به این خواص، مایعات یونی به عنوان یک مایع سبز شناخته شده و به طور گسترده‌ای در استخراج زیست تودهال یا سنتز ارگانیک مورد استفاده قرار می‌گیرد]27[. از مایعات یونی می‌توان برای استخراج کراتین استفاده کرد اما به دلیل گران بودن مایعات یونی، روش مرسومی حتی در مقیاس آزمایشگاهی نیست.

   دهه‌ها پیش با کار زود هنگام ارلاند[11] و همکاران استخراج کراتین به روش اکسیداسیون توسط اسید پراستیک 2% به مدت 30 ساعت و با عملیات با آمونیاک خفیف (2/0 نرمال) و در نهایت رسوب با استفاده از HCl انجام گرفته است]28[. 

   هنگام استفاده از اکسیدکننده‌های قوی مانند پراکسید هیدروژن و یا اسید پرفرمیک باقی‌مانده‌های سیستئین به اسید سیستئیک تبدیل می‌شود. در این فرآیند، تولید کراتوز محلول از طریق یک فرآیند برگشت‌پذیر میسر می‌باشد.

   انفجار ناگهانی بخار (SFE) یک فرآیند هیدرولیز سبز است که برای تولید مواد پایه زیستی به کار می‌رود. در این فرآیند، ماده برای مدت کوتاهی در دمای بالای بخار قرار می‌گیرد که بخار آب در بافت سلول های ماده نفوذ می‌کند و سپس یک فشرده سازی تا حالت مایع و انفجار در واکنش یکی میلی ثانیه‌ای رخ می‌دهد. این فرآیند توسط تزریق بخار به داخل محفظه از طریق ورودی‌ها شروع می‌شود و پس از حدود 5-3 ثانیه فشار به داخل محفظه می‌رسد. محفظه اصلی از یک پیستون و سیلندر تشکیل شده است که در اثر افزایش فشار از طریق حرکت پیستون منفجر می‌شود. شتاب نیروی پیستون با سیستم محرک و نیز انرژی جنبشی بخار داخل محفظه ایجاد می‌شود. انفجار در 0875/0 ثانیه اتفاق می‌افتد. این روش اثر کمی بر محیط زیست می‌گذارد و کم هزینه است]29[.

   استفاده از اشعه مایکروویو برای استخراج کراتین را زوکولا[12] و همکارانش با توان متغیری در محدوده 150 تا 570 وات تا 7 دقیقه و دمای  180 انجام دادند و راندمان 60 درصدی استخراج کراتین را گزارش کردند. نقش پیشنهادی مایکروویو تنها در افزایش دمای محلول و مزیت کلیدی این تکنیک در کاهش زمان فرآیند برای توزیع گرمایش همگن و تولید گرمای داخلی است]30[.

   در مقایسه با فرآیند انفجار بخار برای پر، در دمای  200 برای 10 و 120 دقیقه که توسط تونین[13] و همکاران انجام شده بود، به ترتیب روش مایکروویو در مقایسه با روش انفجار بخار مزیت سرعت بالاتر را دارد. اگر چه به سختی می‌توان از  راندمان مایکروویو در مقایسه با SFE در دمای  50 و زمان کم تر (2 دقیقه) رضایت‌مند بود]31[.

   استفاده از مایکروویو برای استخراج کراتین، منجر به کاهش قابل توجه سیستئین از 41/9 مول درصد به حدود 5/0 مول درصد در نمونه کراتین استخراج شده می‌گردد]30[.

   از دیگر روش‌های استخراج کراتین، استفاده از عملیات میکروبی یا آنزیمی است. تمام کراتین با استفاده از عملیات میکروبی و آنزیمی نمی‌تواند استخراج و یا جدا گردد و به‌عنوان تخریب پروتئین برشمرده می‌شود. با استفاده از این تکنیک مواد غنی از کراتین می‌تواند به پپتیدها تجزیه و هیدرولیز شده و ممکن است در صنعت زیست فناوری یا غذایی کاربرد مفیدی داشته باشد. مواد غنی از پروتئین مانند پشم یا پر، منابع خوب مغذی مانند کربن، نیتروژن و گوگرد برای میکروارگانیسم‌ها در بردارد. از این رو یک رویکرد کاملا متفاوت برای استفاده از ضایعات مواد کراتینه در مقایسه با روش‌های دیگر که قبلا بررسی شده است را داریم.

   آنزیم‌ها به عنوان کاتالیزور دارای مزایای متعددی نسبت به مواد شیمیایی است و به طور گسترده‌ای در فرآیندهای صنعتی و زیست فناوری مورد استفاده قرار می‌گیرد. حدود 80% آنزیم‌های مورد استفاده در سراسر جهان از طریق راه‌های میکروبی تولید می‌شود]32[ و حدود 65% از صنعت آنزیم در واکنش‌های آبکافت مورد استفاده قرار می‌گیرد]33[. پروتئازها به طور گسترده‌ای در پردازش مواد غذایی و نیز برای هیدرولیز پیوندهای پپتیدی در صنایع شوینده مورد استفاده قرار می‌گیرد]34[.

   دسته وسیعی از پروتئازها می توانند در شرایط pH قلیایی در دمای  60-50 در حضور دیگر ترکیبات که منجر به تخریب پیوندهای دی‌سولفیدی موجود در کراتین می‌شود عمل نموده و کراتین هیدرولیز شده حاصل کند. به طور مثال، سدیم هیدروژن سولفیت به‌عنوان احیاکننده به شکستن پیوندهای دی‌سولفیدی در کراتین کمک کرده و اجازه دسترسی به اتصال پلی پپتیدی را به آنزیم پروتئاز می‌دهد و سدیم دودسیل سولفات که یک سطح فعال آنیونیک است، باعث تسریع فرآیند استخراج و نیز پایداری محلول کراتین می‌شود. از سوی دیگر برای تهیه آسان‌تر و راندمان بیش‌تر در تولید کراتین هیدرولیز شده می‌توان از روش‌های ترکیبی نیز بهره برد. به‌عنوان مثال می‌توان از هیدرولیز دو مرحله‌ای قلیایی- آنزیمی استفاده نمود که در این روش کالای پروتئینی مانند پشم را در محلول کلسیم هیدروکسید غوطه ور کرده و سپس کالا را با آنزیم پروتئاز واکنش داده و در انتها پروتئین هیدرولیز شده تولید می‌گردد. تحت شرایط شدیدتر، پشم 60% تخریب می‌شود و غلظت محلول قلیایی در تخریب پشم بالاترین تاثیر را دارد.

• استفاده از کراتین به عنوان زیست ماده:

   پروتئین‌های متعددی در تولید زیست مواد (زیست ماده) پایه طبیعی استفاده شده‌اند که از جمله آنها می‌توان کلاژن، آلبومین، ژلاتین، فیبروئین،  کیتوسان و کراتین را نام برد. از این میان، مواد پایه کراتینی به دلیل زیست ‌سازگاری ذاتی، زیست ‌تخریب‌پذیری، فراوانی و ماندگاری مکانیکی انقلابی عظیم در دنیای زیست مواد ایجاد کرده‌اند[35] .

   زیست ماده‌ها و پتانسیل کارآیی‌شان در زمینه‌های مختلف پزشکی توجه محققان بسیاری را به خود جلب کرده‌ است. استفاده از زیست مواد در مهندسی بافت به ویژه داربست‌ها، به منظور شبیه سازی محیط بدن بسیار توسعه یافته است. به دلیل نقش‌های ویژه بیوشیمیایی، مکانیکی و ساختاری ماکرومولکول‌ها، استفاده از این مواد در تولید زیست ماده‌ها و داربست‌ها گسترش یافته است. خصوصا زیست مواد پروتئینی به دلیل تسهیل بخشی در برهمکنش‌های سلول-سلول و سلول-ماتریس، در کاربردهای بیولوژیکی مورد استفاده قرار می‌گیرند [35].

   کراتین، پروتئینی فوق العاده زیست سازگار و زیست تخریب‌پذیر است، از طرفی حاوی توالی آمینواسیدی RGD  و LDV است که این توالی در پروتئین‌هایی چون فیبرونکتین نیز یافت می‌شود. پیوندهای سلولی کراتین در واحدهای تکرار شونده آن می‌تواند با سایت‌های چسبنده ای که در ماتریس خارج سلولی[14] یافت می‌شود، تطابق یابد[36]. از طرفی همان طور که در بالا نیز به آن اشاره شد، کراتین‌های استخراجی توانایی ذاتی در آرایش یافتگی خودبه‌خودی  و پلیمریزاسیون به داربست‌های فیبری متخلخل را دارند[3]. این خواص در کنار هم یک ساختار سه بعدی فراهم می‌کنند که تصفیه، نفوذ، چسبندگی، رشد و تکثیر سلول‌ها را فراهم می‌کند. بنابراین، کراتین می‌تواند برای ساخت ایمپلنت‌های مهندسی بافت مورد استفاده قرار گیرد[35, 36]. البته لازم است محدودیت‌های کراتین از جمله استحکام مکانیکی پایین و تورم آن در محیط آبی که یکپارچگی آن را از بین می‌برد، برطرف شوند[37]. در ضمن باید به این مسئله نیز توجه شود که کراتین یک مولکول به شدت مقاوم در برابر پروتئاز (مانند پپسین یا تریپسین) بوده و در آب، محلول‌های اسیدی رقیق، آلکالین‌ها و دیگر حلال‌های ارگانیک نامحلول است. کراتین‌ها در حضور مواد دناتورکننده مانند اوره قابل حل خواهند بود[38].

• استخراج کراتین برای تهیه زیست ماده:

   پیش از استخراج کراتین به ویژه از پر مرغ، به دلیل وجود پاتوژن‌های خون در آن و در نتیجه خطرهای بیولوژیک احتمالی، لازم است پرها را شسته، خالص نماییم. برای اینکار از سورفکتانت‌های یونی و غیریونی استفاده می‌شود. برای خروج چربی‌ها استخراج  سوکسله[15] با استفاده از اتانول انجام می‌شود و برای استریل کردن کراتین از اوزون و سدیم کلریت استفاده می‌شود[39].

   کراتین‌های بدست آمده به روش اکسایش با پراستیک اسید یا هیدروژن پراکساید، کراتوز نامیده می‌شوند. کراتوزها جاذب آب بوده، پیوندهای عرضی غیرسولفیدی داشته، محلول در آب بوده و مستعد تخریب هیدرولیتیک در pH های بالا هستند که باعث قطبی شدن زنجیره اصلی به دلیل خواص الکترونی سیستیک اسید می‌شود. این ویژگی‌ها باعث می‌شود که زیست ماده‌ها قادر به تخریب طی چند روز تا چند هفته در محیط درون بدن باشند. استخراج کراتین‌ها به روش کاهش که معمولا در آن از دی تیوتریتول[16]،2-مرکاپتواتانول و تیوگلیکولیک اسید استفاده می شود خروج 80% پروتئین ها را فراهم می‌کند. استخراج با استفاده از سدیم بی سولفات، سیستئین و نمک‌هایی تولید می‌کند که به شکل موقت اصلاح گروه‌های سولفیدی را انجام می‌دهند. کراتین‌های کاهش یافته یا کراتئین‌ها قطبیت کمتری داشته و به تبع آن کمتر در آب حل می‌شوند، در pH های بالا پایدارتر بوده و می‌توانند دوباره از طریق شبکه اکسیداتیو گروه‌های سیستئین پیوند عرضی تشکیل دهند. این مسئله باعث ماندگاری زیست مواد در درون بدن برای چند هفته تا چند ماه می‌شود[40]. این کراتین‌های استخراجی می‌توانند به صورت مستقیم و یا پس از اعمال اصلاحاتی مورد استفاده قرار گیرند. طی مطالعه‌ ای آلکیل کردن کراتئین‌ها مورد مطالعه قرار گرفته است. محققان این مطالعه معتقدند که گروه‌های تیول موجود در کراتئین را می‌توان به راحتی آلکیله نمود که این مسئله نرخ‌های سایش متنوعی برای ژل‌های کراتینی در انتقال دارو به همراه خواهد داشت. در این تحقیق از یدواستامید به عنوان عامل آلکیل کننده سیستین کراتین استفاده شده است. نتایج بدست آمده نشان می‌دهند که ژل‌های ساخته شده از کراتوز، کراتئین و کراتئین اصلاح شده ظاهر یکسانی داشته اند. کراتوزهای بدست آمده مدول الاستیک و مدول ویسکوزیته پایین تری نسبت به کراتئین داشته اند و هیدروژل های اصلاح شده کراتئین، مدول الاستیکی بین کراتوز و کراتئین داشته‌اند که علت کمتر بودن مدول الاستیک کراتئین‌های آلکیل شده نسبت به کراتئین را میتوان کاهش پیوندهای دی سولفیدی حین آلکیلاسیون دانست. این کراتئین های اصلاح شده مدول ویسکوزیته تقریبا مشابهی با کراتئین ها داشته‌اند اما این پارامتر نسبت به کراتوزها به شکل چشمگیری بیشتر بوده است. بررسی زیست سازگاری کراتئین های آلکیل شده نشان می‌دهد که این فرایند اصلاحی تأثیر قابل توجهی در افزایش سمیت کراتین نداشته و توانایی ماده برای جذب سلول ها راحفظ می‌کند. در نهایت نتایج نشان می‌دهند که با کاهش پیوندهای دی‌سولفیدی میزان رهایش مواد درمانی (به استثنای rhBMP-2) افزایش یافته است که این مسئله نقش نرخ فرسایش کراتین را در رهایش دارو  نشان می‌دهد[41]. یکی از روش‌هایی که برای استخراج کراتین از پشم و پر بکار برده شده است اصلاح آنزیمی با استفاده از یک عامل کاهش دهنده می‌باشد. در مطالعه صورت گرفته پیرامون این موضوع، تأثیر پارامترهای مختلفی چون نحوه استفاده از آنزیم، نوع بستر و سورفکتانت، زمان هیدرولیز و غلظت عامل کاهش مورد بررسی قرار گرفته[42,43]و بهترین نتیجه از استفاده از g/L 1 سدیم دودسیل سولفات به عنوان سورفکتانت، 2.6% پروتئاز و 8.6 و 6.4 گرم بر لیتر سدیم هیدروژن سولفات به عنوان عامل کاهش، برای استخراج کراتین از پشم و پر، دریافت شده است[42].  

   امروزه کراتین را می‌توان در ساختارهای مختلفی از جمله پودر، فیلم، ژل، الیاف، اسفنج و فوم یافت که در کاربردهای پزشکی استفاده می‌شود که در ادامه به کاربردهای آنها اشاره خواهد شد.

• زیست ماده های کراتینی و کاربردشان در پزشکی:

   اولین مستندات استفاده از کراتین در کاربردهای پزشکی، به یک گیاه شناس چینی به نام لی شی جن[17] [44] در قرن 16 باز می‌گردد. در مدت 38 سال شی جن، مجموعه‌ای از 800 کتاب نوشته است که حاوی بیش از 11000 دستورالعمل و نسخه گیاهی است. در میان آنها جسمی متشکل از خاکستر بدست آمده از موی انسان به چشم می‌خورد که برای سرعت بخشی به درمان زخم و انعقاد خون استفاده شده است. البته جزئیاتی پیرامون فعالیت‌های بیولوژیک موی مورد استفاده گزارش نشده است.

   در طول سال‌های 1905 تا 1935، روش‌های متعددی برای استخراج کراتین با استفاده از فرایند اکسایش-کاهش بکار رفته است[35]. خواص بیولوژیک کراتین‌های استخراجی توجهات را به سمت استفاده از کراتین در پزشکی سوق داده و در میان اولین ابداعات می‌توان به پودرهای کراتینی که برای کاربردهای زیبایی، کامپوزیت‌ها و پوشش دارو استفاده شدند، اشاره نمود[9].

   دانشمندی ژاپنی به نام نویشیکی[18] [45]، اولین مطالعه پیرامون استفاده از کراتین بدست آمده از پشم در پوشش آنتی باکتریال گرفت رگی برای تخمین انعقاد خون و زیست سازگاری کراتین را انجام داد. طی این مطالعه از 26 سگ برای آزمایشات درون تنی استفاده شد و نتایج ضمن اثبات زیست سازگاری آن، نشان دادند که بیش از 95% پوشش طی 61 روز جذب شده و سلول‌های آندوتلیال جدید جایگزین آنها شده‌اند.

    یامائوچی [46] و همکارانش نیز جزء اولین افرادی بودند که تحقیقات پیرامون خواص محصولات تولید شده از کراتین‌های پشم را آغاز کردند و خواص فیزیکی و شیمیایی و زیست تخریب‌پذیری فیلم های کراتینی را توضیح دادند. این افراد نشان داده اند که فیلم‌های کراتینی خالص برای کاربردهای عملی بسیار حساس و شکننده هستند و با افزودن گلیسرول به آنها، شفافیت، استحکام، انعطاف پذیری و زیست تخریب پذیری را برای آنها فراهم کرده‌اند.

   فوجی[19][47] و همکارانش نیز امکان پیوستن مولکول‌های زیست فعالی چون آلکالین فسفات را به فیلم‌های کراتینی برای کاربردهای کنترلی آنها نشان داده‌اند.

   لی[20][48] و همکارانش ساختار دوم فیلم‌های کراتین/ فیبروئین ابریشم [21]را مورد مطالعه قرار دادند. فیبروئین ابریشم، یکی دیگر از پلیمرهای طبیعی است که به دلیل زیست سازگاری و زیست تخریب‌پذیری ذاتی خود توجهات زیادی را به خود جلب کرده است. لی[49] و همکارانش طی مطالعات خود دریافتند که کویل‌های رندم فیبروئین به دلیل حضور آمینواسیدهای کراتین به β-sheet تغییر یافته‌اند. این فیلم‌های ترکیبی خواص ضد انعقادی خوبی از خود نشان داده و در مقایسه با زیست ماده‌های خالص کراتین و SF، زیست سازگاری بهتری داشته‌اند.

   واسگونزالس[22][50] و همکارانش نیز با بررسی خواص مکانیکی و تخریبی فیلم‌های کراتین/ فیبروئین ابریشم دریافتند که این دو پروتئین می‌توانند برهمکنش‌های منحصر به فردی با هم داشته باشند که خواص توده را تحت تأثیر قرار می‌دهد. این برهمکنش‌ها و آگاهی نسبت به نرخ‌های تخریب، امکان طراحی ماتریسی برای رهاسازی ترکیبات فعالی به منظور استفاده در پزشکی را فراهم می‌کند.

   تونین [51] و همکارانش ارتباط میان پلی اتیلن اکساید[23] و فیلم‌های کراتینی را به منظور بهبود خواص ساختاری کراتین، مورد بررسی قرار دادند. بررسی‌های مورفولوژیکی، ساختاری و حرارتی فیلم‌های کراتین/ PEO نشان داده است که در یک سطح مناسب، کراتین از کریستالی شدن پلی اتیلن اکساید جلوگیری می‌کند و PEO نیز خود سازی کراتین را از طریق القای بیشتر پایداری حرارتی و تغییر ساختار پروتئین، تحت تأثیر قرار می‌دهد. خواص ساختاری بهبود یافته فیلم های کراتین/ PEO، امکان استفاده از مواد کراتینی به عنوان داربست هایی برای رشد سلولی، زخم پوش ها و پوشش های انتقال دارو را فراهم می‌کند.

   اخیرا فیلم‌های کراتینی برای بازسازی سطح چشم استفاده شده‌اند که در آن از پرده آمنیوتیک انسانی استفاده شده است. نتایج نشان می‌دهد که فیلم‌های کراتینی می‌توانند جایگزین غشای آمنیوتیک در چشم پزشکی شوند، زیرا فیلم‌های کراتینی شفاف‌تر و سخت‌تر از پرده آمنیوتیک، با سطح یکسانی از چسبندگی و رشد سلول های اپی تلیال قرنیه هستند[40].

   تاچیبانا[24][52] و همکارانش با استفاده از انجماد خشک محلول‌های آبی کراتین، پس از فریز کردن کنترل شده آن‌ها، اسفنج‌های کراتینی با ساختارهای سخت و پایدار حرارتی با میکروتخلخل‌های همسان تهیه کردند و به عنوان داربست های مهندسی بافت مورد استفاده قرار دادند. کراتین‌ها، که توالی های آمینواسیدی RGD و LDV دارند، سازگاری سلولی خوبی از خود نشان داده و از چسبندگی سلولی و تکثیر فیبروبلاست‌ها حمایت کردند. اسفنج‌های کراتینی اصلاح شده با استفاده از یدواستیک اسید، 2- برواتیل آمین و یدواستامید مشابهت زیادی با ماتریس خارج سلولی پروتئین‌ها از خود نشان داده و حضور گسترده گروه‌های فعال در اسفنج‌ها امکان هیبریداسیون بعدی با مولکول‌های زیست فعال را فراهم می‌کند. تاچیبانا [53,54] و همکارانش از طریق هیبریداسیون اسفنج‌های کراتینی با کلسیم فسفات این مسئله را اثبات کردند. مواد هیبرید شده بدست آمده، از رشد سلول‌های استئوبلاست حمایت کرده‌اند. اسفنج های کربوکسی کراتین با استفاده از پروتئین مورفوژنتیک استخوان[25] نیز تولید شده‌اند. سلول‌های خارج از محل قرارگیری BMP-2 تمایز نیافته‌اند و این نشان می‌دهد که تأثیرات BMP-2 تنها محدود به بخش اصلاح شده اسفنج است. این یافته‌ها برای کاربردهای درون تنی بسیار مطلوب است چرا که انتظار می‌رود استفاده از این داربست‌ها، استخوان سازی داخلی را بهبود بخشیده و از جابه‌جایی‌های ناخواسته استخوانی در خارج از محدوده مورد نظر جلوگیری کند.

   سیرپینسکی هیل[26][55] و همکارانشان نشان داده‌اند که هیدروژل‌های پایه کراتینی خاصیت القای عصبی داشته و در ترمیم آسیب عصبی موش مؤثر واقع شده‌اند. این دانشمندان به چند دلیل معتقدند استفاده از هیدروژل‌های کراتین، که می‌توانند به عنوان ماتریس‌های فیبری عمل کرده و از چسبندگی سلولی حمایت کنند، در ترمیم عصب محیطی[27] بسیار کارآمد است: اول اینکه می‌دانیم فراهم کردن یک ماتریس موقت اولین گام در بازسازی عصب است و برای یک شکاف طولانی عصب ماتریس مطلوبی شکل نمی‌گیرد. ایمپلنت داربست پایه کراتینی اطمینان از حضور داربست را فراهم می‌کند. دوم اینکه داربست‌های پایه کراتینی مناطق پیوندی مانند فیبرونکتین دارند که چسبندگی سلول‌های شوان به ماتریس فراهم شده را تسهیل می‌بخشد. همچنین، زیست ماده‌های پایه کراتینی مهاجرت، رشد، تکثیر و فعالیت سلول‌های شوان را افزایش می‌دهند و سوم اینکه هیدروژل‌های کراتینی مورد استفاده در این مطالعه پس از 3 الی 4 هفته شروع به تخریب می‌کنند که در مقایسه با سایر داربست‌ها، امکان رشد آکسون را فراهم می‌کند. هیدروژل‌های مورد استفاده در عصب تیبیال موش نسبت به اتوگرفت عصب حسی، بهبود الکتروفیزیولوژیک عصب را تسهیل می‌بخشد.

   هیدروژل‌های کراتینی بدست آمده از موی انسان تأثیر بسزایی به عنوان بند آورنده جریان خون در درمان آسیب مهلک کبد در یک مدل خرگوش داشته‌اند. در مقایسه با دیگر عوامل انعقادی، ژل هموستاتیک کراتینی، 24 ساعت حیات را به همراه داشته است و اگر بهتر از باقی عوامل سنتی انعقادی نبوده، به همان اندازه در جلوگیری از خونریزی مؤثر بوده است. ژل کراتینی مورد استفاده در بخش های آسیب دیده از طریق ترومبوز و ایجاد مانع فیزیکی در بخش های زخم به عنوان داربست متخلخل عمل کرده تا فیلتراسیون سلولی و تولید بافت گرانوله را ممکن سازد[35].

شن[28][56] و همکارانش هیدروژل های کراتینی را برای درمان دقیق آنفارکتوس میوکارد بهبود بخشیده اند. هیدروژل های کراتینی بدست آمده از موی انسان در قلب تزریق شده، رگزایی را بهبود بخشیده اند، بدون اینکه التهاب افزایشی و بازسازی ضعیف قلب را داشته باشند و بدین ترتیب عملکرد قلب را حفظ کرده اند.

   طی مطالعه‌هایی که توسط پورانکی[29][57] و همکارانش صورت گرفته است عملکرد زخم پوش‌های کراتینی در مورد زخم‌های حاصل از سوختگی مورد بررسی قرار گرفته است. از ویژگی‌های زخم پوش می‌توان به کنترل ترشحات ناشی از زخم، جداشدن راحت آن از محل زخم، تأمین چسبندگی و رشد سلول‌ها و خواص مکانیکی مطلوب اشاره کرد[58]. نتایج حاصل نشان داده‌اند که هیدروژل‌های کراتینی رطوبت لازم برای درمان زخم را فراهم می‌کنند ضمن اینکه رشد سلول‌های اپیتلیال را سرعت می‌بخشند.       همچنین یافت شده است که نسبت به دیگر درمان‌ها، استفاده از هیدروژل‌های کراتوز، افزایش اندازه زخم را به دنبال نداشته و بسته شدن زخم سریع‌تر صورت گرفته است. همچنین نتایج حاکی از آن است که این هیدروژل‌ها نسبت به کیتوسان و سالین به شکل چشمگیری ناحیه زخم را کاهش داده‌اند.

   پودرهای کراتینی به عنوان جاذب پوشش‌های زخم، بهبود درمان زخم را از طریق رهاسازی پپتیدهای کراتینی به دنبال داشته‌اند. پپتیدهای حلال در آب کراتین که از طریق استخراج اکسیداتیو از موی انسان بدست آمده‌اند به عنوان عوامل درمان زخم مورد استفاده قرار گرفته‌اند که رشد و تمایز سلول های فیبروبلاست درم انسان را تقویت می‌کنند. اخیرا کراتین های بدست آمده از هر دو روش اکسایش و کاهش برای زخم‌های حاصل از سوختگی در مدل‌های انسانی و حیوانی مورد استفاده قرار گرفته‌اند. زخم‌های سوختگی درمان شده به وسیله مواد کراتینی، کاهش اندازه زخم و سرعت بخشی به درمان زخم را موجب شده‌اند. پودرهای کراتینی کراس لینک شده، فیلم‌ها و هیدروژل‌ها رشد چشم‌گیر رده های سلولی مورد نیاز در درمان زخم، مانند سلول‌های اندوتلیال رگ‌ها، کراتینوسیت‌ها و فیبروبلاست‌ها را به همراه داشته است[40].

   ژو [59] و همکارانش از داربست‌های کراتینی برای ایمپلنت گذاری زیرجلدی و برای درمان آسیب‌های پوست موش استفاده کرده‌اند. نتایج، زیست تخریب‌پذیری، زیست سازگاری و عملکرد مثبت زیست ماده‌های کراتینی در درمان زخم را تأیید کرده‌اند. در مقایسه با فرایند خود ترمیمی زخم‌ها، داربست‌های کراتینی، منجر به رگزایی زودتر، انقباض کمتر و ایجاد فولیکول‌های جدید مو می‌شوند.

• کامپوزیت های پایه کراتینی و کاربردشان در پزشکی:

   هونگ بو[30][36] و همکارانش طی تحقیقی استفاده از داربست‌های متخلخل کامپوزیتی کراتین/ کیتوسان در درمان زخم و بازسازی پوست را مورد بررسی قرار دادند. داربست های زیست ماده های مختلف می‌توانند به عنوان یک حامل محافظ، جاذب مواد مترشحه اضافی زخم و نگهدارنده رطوبت محیط عمل کنند که کاهش درد را موجب می‌شود و سرعت بهبود آن را افزایش می‌دهد. کیتوسان دارای خاصیت آنتی باکتریال فوق العاده‌ای می باشد که با اعمال اصلاحاتی می‌تواند در برابر هر دو گروه باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی این خاصیت خود را حفظ کند[36]. همچنین به دلیل قیمت مناسب، فرایند و روش تولید آسان، خواص حمل اکسیژن عالی، زیست تخریب‌پذیری، زیست سازگاری و غیر سمی بودنش کاربردهای فراوانی دارد[60]. انتظار می‌رود که ترکیب کراتین و کیتوسان خواص مکانیکی و فعالیت آنتی باکتریال داربست‌های کامپوزیتی را بهبود بخشد که این مسئله برای درمان زخم و بازسازی پوست بسیار سودمند است. نتایج بدست آمده از این مطالعه نشان می‌دهد که مورفولوژی داربست‌های متخلخل کراتین/ کیتوسان با تغییر نسبت کیتوسان تغییر می‌کند و داربست‌هایی با نسبت کیتوسان بالا، ساختاری شبیه پوست با تخلخل‌های بیضی شکل از خود نشان می‌دهند. افزودن کیتوسان به داربست‌های پایه کراتینی نرخ تورم داربست را با افزایش آبدوستی کاهش می‌دهد. همچنین افزایش غلظت کیتوسان نرخ تخریب را کاهش می‌دهد. نتایج نشان می‌دهند که حضور کیتوسان در این داربست‌ها با افزایش کشسانی، استحکام مکانیکی و مدول یانگ داربست، باعث بهبود خواص مکانیکی آن می‌شوند که این مسئله برای حمایت‌های فیزیکی ترمیم بافت پوست به عنوان یک زخم پوش بسیار حائز اهمیت است. اما از طرفی افزایش غلظت کیتوسان باعث کاهش چشمگیری در میزان تخلخل ها می‌شود که رفتار سلولی را تحت تأثیر قرار می‌دهد. همان طور که در بالا نیز به آن اشاره شد این داربست‌های کامپوزیتی تعداد باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس[31] و اشریشیا کلی[32] را تا بیش از 80% کاهش داده‌اند. سازگاری سلول آن‌ها نیز از طریق کشت سلول‌های فیبروبلاست، که جزء مهمترین رده های سلولی دخیل در ترمیم زخم و پوست می‌باشند، در غلظت مشخصی از کیتوسان اثبات شده است. بهترین مقدار کیتوسان برای ایجاد داربست های کراتین/ کیتوسان  400 میکروگرم بر میلی لیتر است تا بهترین چسبندگی سلولی و رشدو تکثیر  را داشته باشیم. این نتایج نشان می‌دهند که داربست‌های متخلخل کراتین/کیتوسان می‌توانند به عنوان داربست‌هایی برای بهبود درمان زخم و بازسازی پوست مورد استفاده قرار گیرند[36].

   انجلا ادواردز[33][37] و همکارانش با استفاده از روش الکتروریسی موفق به تولید نانوالیاف کامپوزیتی پایه کراتینی در ترکیب با پلی- ای- کاپرولاکتون شده‌اند که این کار مواد جدیدی را برای کاربردهای مهندسی بافت و پزشکی ترمیمی فراهم کرده است. الکتروریسی روشی است که از ولتاژ بالا برای ایجاد الیاف پلیمری از محلول باردار استفاده می‌کند. با اعمال ولتاژ، محلول‌های پلیمری باردار به سمت پایین کشیده شده، به صورت الیاف روی یک جمع کننده که در قسمت پایین دستگاه تعبیه شده است، جمع آوری می‌شوند[35].در میان روش‌های تولید داربست، الکتروریسی به دلیل تولید الیاف بافته نشده و فراهم کردن ساختاری سه بعدی مشابه ساختار [34]ECM بسیار مورد توجه قرار گرفته است[61]. نانوالیاف بدست آمده از این روش فواید زیادی، به ویژه در تولید داربست‌هایی با خواص فیزیکی و شیمیایی نزدیکی با خواص ECM طبیعی دارند. ECM پستانداران از پروتئوگلیکان‌ها و الیاف پروتئین ساخته شده است که هر دوی آن‌ها ساختاری در ابعاد نانو دارند و می‌توانند از طریق مواد بدست آمده از الکتروریسی به خوبی تقلید شوند[6]. به علاوه فراهم ساختن خواصی از جمله نسبت سطح به حجم بالا، تخلخل زیاد، بهبود چسبندگی سلولی، تکثیر و مهاجرت سلول ها این الیاف را برای کاربردهای پزشکی ایده آل میسازد[62]. به همین علت و به دلیل این تشابه با ECM، در هم رفتگی های نانوالیاف بدست آمده این امکان را فراهم آورده است که از آن‌ها برای پوشش زخم، انتقال دارو و مهندسی بافت در بافت های پیچیده‌ای چون استخوان، کبد، قلب، ماهیچه و... استفاده شود. در این مطالعه برای تهیه نانوالیاف، ابتدا کراتین را از موی انسان استخراج کرده و سپس با پلی کاپرولاکتونی[35] که در تترافلوئورواتیلن[36] حل شده است ترکیب می‌کنند. PCL در کاربردهای مهندسی بافت بسیار رایج است ، چراکه خواص مکانیکی و زیست تخریب پذیری مطلوبی دارد اما از طرف دیگر به شدت هیدروفوب بوده و وابستگی سلولی محدودی دارد. بنابراین انتظار می‌رود هیبرید نانو الیاف کراتین/ PCL خواص بیولوژیک مطلوب کراتین و خواص مکانیکی PCL را به همراه داشته باشد. نانوالیاف کراتین/ PCL بدست آمده پیوستگی، یکپارچگی و خواص مکانیکی مطلوبی از خود نشان داده‌اند. نتایج بیانگر این است که افزودن کراتین به PCL باعث افزایش آبدوستی می شود و همچنین کاهش کریستالینیته PCL را به همراه دارد که این کاهش کریستالینیتی می‌تواند نرخ زیست تخریب‌پذیری الیاف را کنترل‌پذیر نماید. زیست سازگاری این نانوالیاف نیز با کاشت سلول های فیبروبلاست[37]  اثبات شده است. مزیتی که تولید این نانوالیاف کامپوزیتی نسبت به دیگر کامپوزیت های بدست آمده در ترکیب با PCL دارند این است که این نانوالیاف برای حفظ استحکام مکانیکی و تأمین یکپارچگی خود نیازمند کراس لینک های شیمیایی که سمی شدن پلیمر نهایی را به همراه دارد نمی‌باشد که این مسئله در کاربردهای پزشکی بسیار با اهمیت است. داربست‌های نانوالیاف کراتین/ PCL بدست آمده از روش الکتروریسی ارزان بوده، ساخت و پردازش آسانی داشته و قابلیت تولید در مقیاس بالا را دارد و استفاده از آن در مهندسی بافت به زودی گسترش خواهد یافت[37].

   یوآن[38][63] و همکارانش کامپوزیت نانوالیاف پلی(هیدروکسی توبیلایت-کو-هیدروکسی وارایت)/کراتین ساخته‌اند که حضور کراتین منجر به ایجاد دانه هایی روی شبکه شده که توزیع وزن مولکولی کراتین را به همراه داشته است.

   حال به تحقیق دیگری اشاره می‌کنیم که به  بررسی عملکرد و ویژگی های کامپوزیت‌های پلی لاکتیک اسید/ کیتوسان/ کراتین برای کاربردهای پزشکی می‌پردازد.

   تاناس[39] و اسپیریدون[40][60] با تولید این کامپوزیت‌ها کارآیی آن‌ها را در مهندسی بافت استخوان مورد ارزیابی قرار داده‌اند. پلی لاکتیک اسید[41] یکی از پلی‌استرهای سنتزی است که از منابع کاملا تجدید شدنی بدست می‌آید. این ماده به دلیل زیست سازگاری و قابلیت جذب به طور گسترده در کاربردهای پزشکی چون نخ های بخیه، داربست‌های مهندسی بافت، دستگاه‌های ارتوپدی و یا سیستم‌های انتقال دارو استفاده شده است، اما این کاربردها به دلیل خواص ذاتی ضعیفش مانند استحکام ضربه کم و پایداری حرارتی پایین محدود شده‌اند. کراتین مورد استفاده در این تحقیق از پر مرغ بدست آمده است. نتایج بدست آمده از تحقیق نشان می‌دهند کیتوسان در ترکیب با PLA باعث بهبود مدول یانگ شده و استحکام کششی PLA را کاهش می‌دهد. افزودن کراتین نیز باعث افزایش استحکام ضربه و کاهش خواص مکانیکی در مقایسه با کامپوزیت کیتوسان/ PLA می‌شود. همچنین پیوندهای کووالانت قوی در ساختار کراتین این ماده را نسبت به تخریب مقاوم می‌کند. خواص جذب سطحی مطلوبی نیز از آن‌ها دریافت شده است. زیست سازگاری این کامپوزیت‌ها نیز از طریق کشت سلول های استئوبلاست[42] روی نمونه‌ها به اثبات رسیده است. در واقع با توجه به نتایج می‌توان نتیجه گرفت که کامپوزیت‌های PLA/ کیتوسان/ کراتین روی زیست پذیری سلول ها تأثیری نداشته و از رشد این سلول‌ها حمایت کرده و فضای مناسب برای تکثیر سلول را فراهم می‌کند، در نتیجه قابلیت استفاده در مهندسی بافت استخوان را دارند.

   ثابت شده است که کراتین ماتریس مناسبی برای انتقال آنتی بیوتیک‌ها و نانوذرات فلزی با فعالیت آنتی باکتریال، مانند یون‌های نقره می‌باشد. همچنین ثابت شده است که کامپوزیت‌های پایه کراتینی، انتقال درون سلولی مواد ضد سرطانی را بهبود می‌بخشند. یک کوپلیمر گرفت کراتین-پلی اتیلن گلیکول[43] در محلول آبی از طریق تیولن سنتز شده است تا یک حامل دارویی جدید با خواص رهایشی 2 برابر فراهم کند. کامپوزیت بدست آمده قابلیت بارگذاری نمک دوکسوروبیسین هیدروکلراید[44]، که برای درمان تومور استفاده می‌شود، را دارد. آزمایشات برون تنی انجام شده نشان میدهند که نانوذرات گرفت کراتین-PEG که با DOX پوشش داده شده‌اند، با بازدهی بالایی ذرات فعال را به درون سلول وارد می‌کنند. به دلیل پخش بافت و الگوهای بیان مشخصه ویژه آنها در انواع مشخص سلول، مراحل تمایز و موقعیت های عملکردی، کراتین‌ها به عنوان نشانگر انواع مختلف سلول استفاده شده اند. کاربرد کراتین به طور ویژه برای سرطان‌هایی با تمایز هیستولوژی ضعیف، سرطان‌های پخش شده در چند ارگان و متاستاز یک تومور اولیه ناشناخته می‌باشد[38].

• برتری های کراتین:

   نتایج نشان می‌دهد که کراتین می‌تواند از حل شدن کامل قرص‌ها در معده جلوگیری کند. در هر نوعی از محلول‌ها، قرص‌های پوشش داده شده با کراتین بیشترین زمان عدم انحلال را در مقایسه با قرص‌های ژلاتینی دارند. کراتین در اسید معده نامحلول است اما در روده قابل حل است. کراتین خالص شده، در محیط روده که ترکیبی از آب و الکل  است پراکنده می‌شود. پیش از استفاده ازمحلول کراتینی برای دستیابی به فیلم پیوسته لازم است قرص‌ها ابتدا با لایه نازکی از روغن کاکائو پوشش داده شوند[38].

   اکثر نانوالیاف ساخته شده از طریق آمیختن پلیمرهای طبیعی و سنتزی مانند کلاژن-PCL  و ژلاتین- PCL برای حفظ استحکام مکانیکی و تأمین یکپارچگی ساختاری‌شان در محیط آبی، نیازمند برقراری پیوندهای عرضی شیمیایی هستند که اکثر این اتصالات سمی است اما نانو الیاف پلیمری کراتین- PCL بدست آمده از روش الکتروریسی بدون تشکیل این اتصالات نیز استحکام مکانیکی مورد نیاز ما را دارا می‌باشد[37].

    نتایج مطالعات صورت گرفته حاکی از آن است که چسبندگی سلولی روی زمینه کراتینی بیشتر از چسبندگی روی کلاژن بوده است، همچنین رشد و تمایز سلولی در بسترهای کراتینی مورد حمایت بیشتری قرار گرفته است[2]. از طرفی داربست‌های کراتینی به سرعت کلاژن تخریب نمی‌شوند[7]. زخم پوش های کلاژنی در محل زخم حاصل از سوختگی که به شدت پروتئولیتیک است، به سرعت تخریب می‌شوند در حالی‌که زخم پوش‌های کراتینی ماندگاری بیشتری دارند. کیتوسان در کل خواص تخریبی ضعیفی دارد[36]. کیتوسان و آلیجینات به دلیل ویژگی‌های فیزیکی خود، توانایی ذاتی تسهیل بهبود زخم از جمله زخم‌های سوختگی را ندارند. به علاوه از دیگر نقاط منفی زخم پوش‌های آلیجینات می‌توان سمیت سلولی و تحریک پاسخ‌های ایمنی آن را نام برد، در حالی‌که کراتین هیچ یک از این مشکلات را ندارد[57].

   ترکیب کراتین با سلولز، الیافی با خواص جذبی بهتر، رطوبت‌پذیری بالاتر و زاویه ترشوندگی کمتری نسبت به الیاف سلولز خالص فراهم می‌کند. به علاوه، الیاف سلولز-کراتین زیست تخریب‌پذیری بهتری نسبت به الیاف سلولز دارند[35]. 

• نتیجه گیری

   اگرچه کراتین برای دهه‌های طولانی مورد بررسی قرار گرفته است اما هنوز هیچ زیست ماده کراتینی به شکل کلینیکی گسترده استفاده نمی‌شود. در این مقاله به کاربردهای زیست ماده‌ها و کامپوزیت‌های کراتینی در پزشکی اشاره شده است. زیست ماده‌های کراتینی فواید زیادی برای بیومولکول‌های متداول دارند و می‌توانند به دلیل زیست سازگاری و زیست تخریب‌پذیری مطلوب، تمایل به خودسازی و شیمی منحصر به فردشان در جهت بهبود زیست ماده‌های حاضر مورد استفاده قرار گیرند. فرم‌های مختلف زیست ماده‌های کراتین از جمله فیلم‌ها، هیدروژل‌ها، اسفنج‌ها و الیاف کراتینی با نتایج مطلوبی در سیستم‌های مدرن انتقال دارو، کاربردهای زیبایی، درمان زخم، مهندسی سلول و بافت (استخوان، پوست، گرفت های رگی و بازسازی عصب) مورد استفاده قرار گرفته‌اند. با شناخت بهتر این ماده و ویژگی‌های آن و همچنین گسترش مطالعات پیرامون روش‌های بهبود خواص مکانیکی و فیزیکوشیمیایی ترکیبات کراتینی، انتظار می‌رود که استفاده از آن‌ها در زمینه‌های مختلف پزشکی گسترش یابد.]2-65-66 [

[1] Intermediated Filaments

[2] Cell Signaling

[3] Schrooyen

[4] Gupta

[5] Kiyahara

[6] Nakamura

[7] Shinshu

[8] Shindai

[9] Yamauchi

[10] Xu

[11] Earland

[12] Zoccola

[13] Tonin

[14] ECM

[15] soxhlet

[16] DTT

[17] Li Shi-Zhen

[18] Noishiki Y

[19] Fuji

[20] Lee

[21] SF

[22] Vasconceles

[23] PEO

[24] Tachibana

[25] BMP-2

[26] Sierpinski Hill

[27] peripheral

[28] Shen

[29] Poranki

[30] Hong Bo

[31] S. aureus

[32] E. coli

[33] Angela Edwards

[34] Extracellular Matrix

[35] PCL

[36] TFE

[37] 3T3

[38] Yuan

[39] Tanase

[40] Spiridon

[41] PLA

[42] MG63

[43] PEG

[44] DOX